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Abschlussbericht für das Projekt
„Analysis of 14-3-3 sigma Expression in Colorectal Carcinoma and its Impact on Resistance to Chemotherapeutic Agents“
gefördert von der Österreichischen Gesellschaft für chirurgische Onkologie ACO-ASSO mit dem Georg Stumpf Stipendium 2006 (10.000 Euro)
Einleitung
14-3-3 sigma ist ein kleines intrazelluläres Protein von 28-33 kDa Größe, das in Epithelzellen beinahe ubiquitär gebildet wird und gemeinsam mit p53 an zahlreichen physiologischen Zellfunktionen wie Zellzyklusregulation, Apoptose und Signaltransduktion beteiligt ist. Zahlreiche Untersuchungen in den letzten Jahren haben gezeigt, dass 14-3-3 sigma auch bei der malignen Transformation von Zellen eine wichtige Rolle spielt: der Verlust der 14-3-3 sigma Expression geht beispielsweise beim Mammakarzinom mit einer signifikanten Tumorprogression einher. Unsere eigenen immunhistochemischen Untersuchungen bei Patienten mit einem Kolonkarzinom ergaben hingegen eine deutliche Zunahme der 14-3-3 sigma Expression mit steigender Dedifferenzierung des Karzinoms. Wir konnten darüber hinaus nachweisen, dass die Überexpression von 14-3-3 sigma einen unabhängigen negativen prognostischen Marker für das Gesamtüberleben der Patienten darstellt („14-3-3 sigma expression is an independent prognostic parameter for poor survival in colorectal carcinoma patients.“ Clinical Cancer Research, May 2005, Perathoner et al.). Unsere bisherigen Ergebnisse lassen vermuten, dass 14-3-3 sigma überexprimierende Dickdarmkarzinome möglicherweise apoptose-resistent sind. Unterstützt wird diese These durch andere Publikationen, die zeigten, dass 14-3-3 sigma durch Bindung an Bad und Bax deren proapoptotische Wirkung aufheben kann. Für die Therapie maligner Tumoren ist dieser Effekt von größter Wichtigkeit, da ja jede Chemotherapie primär darauf abzielt, Krebszellen durch Induktion der Apoptose zu eliminieren. Beim Dickdarmkarzinom ist 5-Fluorouracil (5-FU) das am meisten verwendete Chemotherapeutikum. Resistenz gegen 5-FU, z.B. durch Überexpression von Thymidylatsynthase (TS), ist eine der Hauptursachen für das Scheitern einer entsprechenden Chemotherapie. Ein besseres Verständnis dafür, wie 14-3-3 sigma Apoptoseprozesse beeinflusst und verhindert, könnte wertvolle Hinweise dafür liefern, wie Tumorzellen im Dickdarm effektiver eliminiert werden können. Ziel des vom Georg-Stumpf Stipendium der ACO-ASSO unterstützten Projekt war es daher, entsprechende experimentelle in vitro Untersuchungen durchzuführen, um Zusammenhänge zwischen der Expression von 14-3-3 sigma und der Sensitivität von Tumorzellen gegenüber Chemotherapeutika in Kolonkarzinom-Zelllinien zu analysieren. (Erhöht ein „knock down“ von 14-3-3 sigma in vitro die Sensitivität gegenüber 5-FU? Wie reagieren Tumorzellen, die 14-3-3 sigma überexprimieren, in vitro auf Chemotherapeutika?). Darüber hinaus sollten allfällige Promotorelemente ausgeforscht werden, welche die Expression von 14-3-3 sigma regulieren.
Untersuchungen und Ergebnisse
Zunächst war es notwendig, in einem ersten Schritt diverse Kolonkarzinomzelllinien mit unterschiedlicher Expression von 14-3-3 sigma und unterschiedlichem Resistenzverhalten gegenüber dem Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (5-FU) zu generieren. Nach entsprechenden Vorarbeiten wurden hierfür einerseits die Zelllinien HT29 und SW480 ausgewählt, welche 14-3-3 sigma negativ und 5-FU sensitiv sind, und andererseits die Zelllinien HT29-12, HT29-21, DLD1 und Lovo selektioniert, welche 14-3-3 sigma positiv und resistent gegen Behandlung mit 5-FU sind. Für die Durchführung der geplanten Analysen musste die Expression von 14-3-3 sigma in den bestehenden Zelllinien künstlich so modifiziert werden, dass sowohl eine nachweisbare Überexpression, als auch eine eindeutige Blockade der Expression von 14-3-3 sigma erzielt werden konnte, d.h. in 14-3-3 sigma negativen Zellen wird 14-3-3 sigma überexprimiert und in 14-3-3 sigma positiven Zellen wird die Expression von 14-3-3 sigma blockiert.
Für die Herstellung von Kolonkarzinomzellen mit einer stabilen Überexpression von 14-3-3 sigma („Phase I, Part A: Generation of 14-3-3 sigma overexpression in CRC cell lines“) wurde das 14-3-3 sigma Gen in einen speziellen Vektor (pcDNA4/TO) eingebaut und jede 14-3-3 sigma negative Zelllinie anschließend mit diesem Vektor transfiziert. Die Effizienz der Transfektion wurde mittels Western Blot überprüft und bestätigt. Im Gegenzug musste im nächsten Arbeitsschritt die 14-3-3 sigma Expression in 14-3-3 sigma positiven Zellen elimiert werden („Phase I, Part B: Generation of stable siRNA mediated 14-3-3 sigma knock down in CRC cell lines“). Erzielt werden konnte dies durch die Technik der so genannten RNA Interferenz, bei der durch eigens konstruierte kleine RNA Sequenzen (siRNA) eine gezielte Genblockade erreicht werden kann. Die kommerziell erhältlichen entsprechenden 14-3-3 sigma spezifischen RNA Sequenzen wurden durch Transfektion in die 14-3-3 positiven Kolonkarzinomzellen eingebracht und das Ausmaß der 14-3-3 sigma Genblockade mittels PCR und Western Blot überprüft.
Die bereits vorhandenen Zelllinien und die neu gezüchteten 14-3-3 sigma überexprimierenden und 14-3-3 negativen Zelllinien wurden anschließend mit dem Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil nach einem exakt definierten Schema mit unterschiedlichen Zeitintervallen und Dosierungen behandelt. Der entsprechende Effekt des Chemotherapeutikums wurde durch Messung von Zellproliferation, Apoptose und Hemmkonzentration des Chemotherapeutikums beurteilt. Die Ergebnisse zeigten erwartungsgemäß eine geringe Resistenz der 14-3-3 negativen Zellen gegenüber dem Chemotherapeutikum 5-Fluorouracil (hohe Apoptoserate), während die 14-3-3 positiven Zellen einen dramatischen Anstieg der Chemotherapieresistenz zeigten (geringe Apoptoserate).
Der zweite Teil des Projektes wurden Promotoranalysen durchgeführt um Proteine zu identifizieren, die an der aberranten Expression von 14-3-3 sigma in Tumorzellen beteiligt sind. Solche Proteine könnten interessante Targets für eine unterstützende Therapie darstellen. Mit Hilfe von Reporter- und EMSA-Assays, und anschließender Proteinsequenzierung mittels MALD-TOFF wurden mehrere verschiedene Transkriptionsfaktoren (z.B. AP-1, EGR-3, Pit-1, NFE2, GCMa, IRF8, and Oct1) als mögliche Regulatoren der 14-3-3 sigma Transkription identifiziert, die in weiteren Analysen noch auf ihre Spezifität und genaue Wirkung untersucht werden sollen.
An dieser Stelle sei der Österreichischen Gesellschaft für chirurgische Onkologie und ihrem Gönner Herrn Mag. Georg Stumpf noch einmal herzlichst für die großzügige finanzielle Unterstützung dieses Projektes gedankt. Das Georg Stumpf Stipendium stellt ein überaus wichtiges Förderinstrument für junge onkologisch interessierte forschende Chirurgen dar und bestätigt die kontinuierlich zunehmende Bedeutung der chirurgischen Onkologie in der Medizin in Österreich.
Dr. Alexander Perathoner
Medizinische Universität Innsbruck, Department Operative Medizin
Universitätsklinik für Viszeral-, Transplantations- und Thoraxchirurgie
Anichstr. 35, A-6020 INNSBRUCK
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